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細(xì)胞復(fù)蘇技巧,科研助手來支招

更新時間:2024-10-10      點擊次數(shù):463

細(xì)胞復(fù)蘇技巧,MDL科研助手來支招

細(xì)胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細(xì)胞在體外模擬體內(nèi)環(huán)境下,使其生長繁殖,并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物可以是單個細(xì)胞,也可以是細(xì)胞系。細(xì)胞復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié),下面小編具體給大家介紹下細(xì)胞復(fù)蘇的protocal和注意事項!


01、細(xì)胞復(fù)蘇的原理


細(xì)胞復(fù)蘇是指將凍存在液氮或者-70℃冰箱中的細(xì)胞解凍之后重新培養(yǎng),細(xì)胞恢復(fù)生長的過程。當(dāng)恢復(fù)到常溫狀態(tài)時,細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)保持正常,生化反即刻恢復(fù)。細(xì)胞復(fù)蘇過程升溫要快,原則是慢凍快融,防止在解凍過程中水分進入細(xì)胞,形成冰晶,影響細(xì)胞存活。


02、細(xì)胞復(fù)蘇的實驗步驟

1. 從液氮罐中取出凍存管,置于-80℃冰箱數(shù)分鐘,迅速放入37℃水浴鍋中,不時搖動,使其在2min內(nèi)急速融化,注意不要把凍存管的管口沒入水浴中避免引起污染,復(fù)蘇過程中一般細(xì)胞死亡率在25%左右;


2. 融化后,凍存管用75%酒精擦拭冷凍管外殺菌后,打開蓋子,取出凍存管的細(xì)胞懸液,緩慢加入到有培養(yǎng)液的T25或者是T75的培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO培養(yǎng)。如果細(xì)胞需要去除冷凍保護劑,用移液槍將細(xì)胞懸液注入15mL無菌離心管中,

再加5ml培養(yǎng)基,根據(jù)細(xì)胞類型選擇合適的離心速度,低速離心5min,棄去上清,加入2-3mL預(yù)熱的培養(yǎng)基,輕輕吹勻,保證細(xì)胞重懸;


3. 用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后,將重懸的細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿或者T25或者是T75的培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO培養(yǎng),24h后,更換新鮮培養(yǎng)基,去除死細(xì)胞,三天可進一次換液,當(dāng)細(xì)胞長到有80-90%匯合進行傳代。


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03、細(xì)胞復(fù)蘇的注意事項


1. 取凍存細(xì)胞時應(yīng)做好防護措施,戴好防凍手套,護目鏡。如果凍存管密封不嚴(yán),液氮可被吸入。由于解凍時凍存管中的氣溫急劇上升,將可能發(fā)生爆炸。



2. 細(xì)胞放入水浴中復(fù)蘇時注意用鑷子夾住細(xì)胞凍存管并在水浴中不時晃動,使其受熱均勻,且速度越快越好,這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力,并防止水浴鍋的水進入細(xì)胞凍存管造成細(xì)胞污染。


3. 打開細(xì)胞凍存管之前要用酒精棉球?qū)龃婀芟静⒘栏伞W⒁鉄o菌操作,細(xì)胞復(fù)蘇后的操作在4℃冰盒中進行,以減少冷凍保護劑對細(xì)胞的毒性。


4. 解凍時間在2min以內(nèi)完成,且整個過程盡量避免吹打細(xì)胞產(chǎn)生氣泡,導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)蘇后的生長狀態(tài)不佳。


5. 復(fù)蘇細(xì)胞的時候盡量避免凍存管接縫處沾水,防止支原體污染,實驗室定期用過氧化氫熏蒸,細(xì)胞小黑點增多時用支原體檢測試劑盒檢測,并且及時清除。


04、如何避免凍存管爆炸

1.  選擇質(zhì)量好的進口內(nèi)旋凍存管,擰緊蓋子,防止液氮進入管內(nèi),液氮罐的細(xì)胞留種用,平時常用的細(xì)胞放在-80冰箱。


2. 凍存細(xì)胞時盡量加多一點凍存液,比如2ml凍存管加1.8ml凍存液,保留少量空間。


3. 取細(xì)胞時帶好手套和防護眼鏡,準(zhǔn)備好鑷子,避免手直接接觸凍存管造成手凍傷或炸傷。


4. 從液氮里取出細(xì)胞時,先在液氮罐上面的蒸汽里放一會,然后再拿出來,將凍存盒殘余的液氮流到罐內(nèi),避免拿出時凍傷,也避免細(xì)胞從液氮迅速升到室溫發(fā)生爆炸。


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