實(shí)驗原理

培養(yǎng)細(xì)胞傳代根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法。貼壁生長的細(xì)胞用消化法傳代；部分貼壁生長的細(xì)胞用直接吹打可傳代；懸浮生長的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打傳代。

實(shí)驗材料 細(xì)胞

試劑、試劑盒 D-Hanks液、小牛血清、RPMI1640、雙抗、胰蛋白酶、EDTA、NHCl、NaHCO3

儀器、耗材 凈化工作臺、離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、吸管、玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、吸頭、槍頭、膠塞、離心管、量加樣槍、廢液缸、紅血球計數(shù)板

實(shí)驗步驟

1.  貼壁細(xì)胞的消化法傳代：

（1）吸除或倒掉瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。

（2）D-Hanks液洗2～3次。

（3）向瓶內(nèi)加入適量消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面。

（4）然后吸掉或倒掉消化液后再加適量新的消化液，輕輕搖動再倒掉大部分消化液，僅留少許進(jìn)行消化（也可不采用上述步驟直接加消化液進(jìn)行消化）。

（5）消化最好在37℃或室溫25℃以上環(huán)境下進(jìn)行。

（6）消化2～5 min 后把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即終止消化。

（7）吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液數(shù)毫升，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶把殘留消化液沖掉。

（8）再加培養(yǎng)液。如僅用胰蛋白酶可直接加少許含血清的培養(yǎng)液，終止消化。

（9）用彎頭吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，吹打過程要順序進(jìn)行。

（10）從培養(yǎng)瓶底部一邊開始到另一邊結(jié)束，以確保所有底部都被吹到，使細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液。吹打時動作要輕柔不要用力過猛。  

（11） 計數(shù)，分別接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。

2.  懸浮細(xì)胞的傳代：懸浮細(xì)胞傳代可離心收集細(xì)胞后傳代，或直接傳代。

離心傳代法：

（1） 將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到15 ml 離心管內(nèi)。

（2） 離心800~1000 rpm，5 min。

（3） 棄去上清，加新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi)，用吸管吹打形成細(xì)胞懸液。

（4） 計數(shù)，分別接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。 

（5）直接傳代即讓懸浮細(xì)胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清液吸掉1/2~2/3，然后用吸管吹打形成細(xì)胞懸液后再傳代。

3.  部分貼壁細(xì)胞的傳代

（1）部分貼壁不牢的細(xì)胞，如Hela細(xì)胞等，不經(jīng)消化處理直接吹打可使細(xì)胞從壁上脫落下來，而進(jìn)行傳代。

（2）對絕大部分貼壁生長的細(xì)胞，因直接吹打?qū)?xì)胞損傷較大，細(xì)胞常有較大數(shù)量的丟失，因而需消化后，才能吹打傳代。

注意事項

1.  胰蛋白酶要預(yù)溫，溫度37℃左右為宜℃。

2.  離心轉(zhuǎn)速要合適，轉(zhuǎn)速過低，不能有效分離細(xì)胞，離心速度過大，時間過長，會擠壓細(xì)胞造成損傷甚至死亡。

3.  要定時觀察細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)污染，應(yīng)及時處理。

發(fā)布人：上海雅吉生物科技有限公司